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馬皰疹病毒4型(EHV-IV)熒光PCR檢測(cè)試劑盒說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：馬皰疹病毒4型(EHV-IV)核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(PCR 熒光探針法)
Name ：Equine herpesvirus type 4 (EHV-IV) nucleic acid amplification detection kit (PCR fluorescence probe method)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于檢測(cè)全血等樣本中的馬皰疹病毒4型(EHV-IV)，用于馬皰疹病毒4型(EHV-IV)感染的輔助診斷，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒用一對(duì)馬皰疹病毒4型(EHV-IV)特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)馬皰疹病毒4型(EHV-IV)的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
核酸提取液 1.5ml×2 管
酶液 50μl×1 管
YP 反應(yīng)液 1.0ml×1 管
YP 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管
說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件和有效期】
試劑盒保存于-20±5℃，有效期 12 個(gè)月；
避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次；試劑開瓶后，在室溫條件下放置時(shí)間不
應(yīng)超過 8 小時(shí)；運(yùn)輸采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運(yùn)輸時(shí)間不應(yīng)超過 4 天。試
劑盒生產(chǎn)日期見產(chǎn)品標(biāo)簽。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本要求】
標(biāo)本采集：用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管
保存運(yùn)輸：上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過
6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
取抗凝血下層血細(xì)胞 50uL，加入 100uL 雙蒸水吹勻
1.2DNA 提取
1) 對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入等體積核酸提取液（固體標(biāo)本加入50uL核酸提取液），
100℃恒溫處理 10 分鐘，13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5ml
EP 管，-20℃保存；
2) DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑
盒（離心柱提取法），請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性
對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 YP 反應(yīng)液 酶液
用量（樣本數(shù)為 N） 20μl 1μl
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反
應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；
熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）
NONE，請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出
現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍
內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上
下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；
可疑：檢測(cè)通道 35.0<Ct 值≤37，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35.0<Ct
值≤37，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>37 或無 Ct 值。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32；
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
8. 產(chǎn)品性能指標(biāo)
陰陽性參考品符合率：8 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合
率為 100％。
低檢測(cè)限：2.0×102copies/ml。
精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均≤3%。
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