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黃曲霉總量快速檢測(cè)試劑盒（ELISA法）
使用說明書
（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
黃曲霉是由黃曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要污染玉米、花生、堅(jiān)果等。黃曲霉以 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2 這四種毒素為主，黃曲霉總量一般是指這四種毒素的總量。它們是 I 類致癌物，被證明對(duì)人和動(dòng)物的肝臟、腎臟等組織和器官具有很大的危害，是一類毒性很強(qiáng)的致癌物質(zhì)。
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)谷物、花生、飼料等樣品中的黃曲霉，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的黃曲霉和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗黃曲霉抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含黃曲霉含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.02ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測(cè)下限：
谷物……………………………………0.1ppb
飼料……………………………………0.2ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
黃曲霉B1…………………………100%
黃曲霉B2…………………………80%
黃曲霉G1…………………………75%
黃曲霉G2…………………………45%
黃曲霉M1…………………………8%
2.5 樣本回收率：
谷物及配合飼料……………………85%±15%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.02ppb、0.04ppb、0.08ppb、0.16ppb、0.32ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb …………………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋） …………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋） ………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個(gè)
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：樣本提取液
70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。
配液2：工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 谷物處理方法
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加5ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；
3）取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：5 檢測(cè)下限：0.1ppb
5.3.2 配合飼料處理方法
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；
3）取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10 檢測(cè)下限：0.2ppb
（若樣本中黃曲霉含量較高，可取2）步驟中已混勻的液體，以35%甲醇進(jìn)行稀釋，此時(shí)樣本稀釋倍數(shù)則為實(shí)際稀釋倍數(shù)。例如：取2）步驟中液體以35%甲醇10倍稀釋，實(shí)際稀釋倍數(shù)為10×10=100，檢測(cè)下限：2ppb）
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編 號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯 色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間）。
6.5 終 止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 黃曲霉總量快速檢測(cè)試劑盒（ELISA法）貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
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