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玉米赤霉烯酮快速檢測試劑盒（ELISA法）
使用說明書
（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測谷物、飼料、食用油、啤酒、醬油等樣本中的玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）（又稱F-2 毒素），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的玉米赤霉烯酮和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗玉米赤霉烯酮抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含玉米赤霉烯酮含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中玉米赤霉烯酮的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.3ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
谷物及及其食品原料…………………6ppb
飼料及飼料原料………………………18ppb
玉米皮、麥麩…………………………18ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
玉米赤霉烯酮……………………100%
玉米赤霉酮………………………13%
玉米赤霉醇………………………＜1%
2.5 樣本回收率：
谷物及及其食品原料…………………90%±15%
飼料及飼料原料………………………80%±15%
玉米皮、麥麩…………………………80%±15%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb、24.3ppb
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）…………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：甲醇、去離子水
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：樣本提取液
90%甲醇，即V甲醇:V去離子水=V9：V1。
配液2：工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）及其食品原料
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加8ml樣本提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.5ml上清，加入2ml去離子水，混勻；
3）取50μl進(jìn)行分析。
稀釋倍數(shù)：20 檢測下限：6ppb
5.3.2飼料及飼料原料
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加8ml樣本提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.5ml上清，加入1ml提取液，震蕩混勻；
3）取0.5ml混勻液體，加入2ml去離子水，混勻；
4）取50μl進(jìn)行分析。
稀釋倍數(shù)：60 檢測下限：18ppb
5.3.3 玉米皮、麥麩等吸水性強的樣本
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加24ml樣本提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取0.5ml上清，加入2ml去離子水，混勻；
3）取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：60 檢測下限：18ppb
注：由于毒素在樣本中的分布呈非均勻狀態(tài)，取樣時需多點取樣充分混勻后再取2g進(jìn)行試驗。
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編 號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯 色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。
6.5 終 止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 玉米赤霉烯酮快速檢測試劑盒（ELISA法）貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
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