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禽流感通用/H5亞型(AIV-U/H5)熒光PCR試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱：禽流感通用/H5亞型（AIV-U/AIV-H5）?核酸檢測試劑盒(實時熒光-PCR法)
Name ：Avian influenza universal/H5 subtype (AIV-U/AIV-H5) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence-PCR)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
禽流感是由A型流感病毒所引起的禽類疾病。禽流感通用/H5亞型（AIV-U/AIV-H5）除了感染禽類外，部分亞型也能夠引起人感染或發病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對其不致病，當它們傳染給其它物種時有時會造成大的發病率和死亡率。
本試劑盒適用于檢測標本中的禽流感通用/H5亞型（AIV-U/AIV-H5），適用于禽流感通用/H5亞型（AIV-U/AIV-H5）?感染的輔助診斷及流行病學調查。
【檢驗原理】
本試劑盒分別對禽流感AIV-U和H5?設計特異性的引物和探針，用一步法熒光RT-PCR技術對AIV-U/H5 RNA進行體外擴增檢測。
【試劑組成】
名 稱 規 格
酶液 50μL×1 管
AIV-H7N9 反應液 1.0mL×1 管
AIV-H7N9 陽性質控品 50μL ×1 管
陰性質控品 250μL ×1 管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 7 次，有效期 9 個月。
【適用儀器】
ABI 系列 、安捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2 、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100 μL 提取。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 AIV-H7N9 反應液 酶液
用量 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2
設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道
（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
FAM 通道為禽流感病毒 H7N9 亞型 H7 基因檢測結果，CY5 通道為禽流感病毒H7N9 亞型 N9 基因檢測結果
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現 Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。
6.檢測方法的局限性
樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定 量檢測不準確的結果；
本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【參考文獻】
[1]Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13.
[2]羅思思, 謝芝勛, 劉加波, 等. H7N9 亞型 AIV 雙重實時熒光定量 RT-PCR 檢測方法的建立[J]. 動物醫學進展, 2013, 34(12):1-5.
[3]徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重熒光 RT-PCR 檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報, 2014, 12, 36: 939-942.
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