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豬圓環1型/偽狂犬PCV-2/PRV)熒光PCR試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱：豬圓環病毒1型/豬圓環病毒2型/偽狂犬病毒(PCV-1/PCV-2/PRV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)?
Name ：Porcine circovirus type 1 / porcine circovirus type 2 / pseudorabies virus (PCV-1/PCV-2/PRV) nucleic acid detection kit (fluorescent -PCR method)?
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測標本中的禽流感病毒 H7N9，適用于禽流感病毒 H7N9 感染的輔助診斷及流行病學調查。
【檢驗原理】
本試劑盒分別對禽流感病毒 H7N9 亞型的 HA 和 NA 基因設計特異性的引物和探針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術對禽流感病毒 H7N9 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 7 次，有效期 9 個月。
【適用儀器】
ABI 系列 、安 捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 提取。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對
照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 AIV-H7N9 反應液 酶液
用量 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反
應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
7. 質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【參考文獻】
[1] Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13. [2] 羅思思, 謝芝勛, 劉加波, 等. H7N9 亞型 AIV 雙重實時熒光定量 RT-PCR 檢測方法的建立[J]. 動物醫學進展, 2013, 34(12):1-5. [3] 徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重熒光 RT-PCR 檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報, 2014, 12, 36: 939-942.
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