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麥ubiquitine基因熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書
【產品名稱】
通用名稱：麥ubiquitine基因核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：Nucleic acid detection kit for wheat ubiquitine gene (fluorescence-PCR)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
動物源性成分廣泛分布于食品、飼料、化妝品等，與人們的生活息息相關，其中食品和飼料所占的比例大。肉及肉制品摻假成為世界各國共同關注的熱點問題，肉食品及其飼料的安全隱患直接關系到人類的安危。近幾十年來，以PCR技術為核心的動物源性成分檢測獲得了廣泛應用。
本試劑盒適用于動物組織以及食品、飼料等樣本中麥ubiquitine基因的檢測。
【檢驗原理】
本試劑盒對麥ubiquitine基因保守區設計特異性的引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術對核酸進行體外擴增檢測，從而達到快速檢測之目的。
【試劑組成】
名 稱 規 格
酶液 50μL×1 管
Chicken 反應液 1.0mL×1 管
Chicken 陽性質控品 50μL ×1 管
陰性質控品 250μL ×1 管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次。有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過6個月，標本運送應采用0℃。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理：
取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2DNA 提取
DNA 的提取推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2判斷
a)檢測通道 Ct 值＜30.0，有 FAM 熒光信號檢出，并出現明顯的擴增曲線，判斷樣品為陽性。
b)當 30.0≤Ct 值≤35.0 時，且有明顯的擴增曲線時，則需重復實驗。再次擴增后檢測體系的Ct 值仍≤35.0，且有明顯的擴增曲線，則判定該樣品含有相應的動物源性成分。當再次擴增后，檢測體系 Ct 值＞35.0，或無明顯的擴增曲線，則判定該樣品不含相應的動物源性成分。
6.檢測方法的局限性
1）樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2）樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
3）陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
4）病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5）不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6）試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或 定量檢測不準確的結果；
7）本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質控標準
a)空白對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現典型的擴增曲線。
b)陰性對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現典型的擴增曲線。
c)陽性對照：有 FAM 熒光信號檢出，并出現典型的擴增曲線，Ct 值＜30.0。
d)以上應同時滿足，否則本次實驗無效。
【注意事項】
1）所有操作嚴格按照說明書進行；檢驗過程中，參照《GB/T 27403 實驗室質量控制規范 食品分子生物學檢測》的規定進行。
2）試劑盒內各種組分使用前應自然融化，混勻并短暫離心；
3）反應液應避光保存；
4）反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5）使用一次性吸頭、一次性手套和各區工作服；
6）樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
7）實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8）試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全 通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]商務部. SB/T 10923-2012 肉及肉制品中動物源性成分的測定實時熒光 PCR 法[S]. 北京:中國標準出版社, 2012.
[2]王琰. 兔源性食品的PCR-mtDNA 鑒別[J]. 山東師范大學, 2013.
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