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偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)熒光PCR試劑盒說明書
【產品名稱】
通用名稱：偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：Pseudorabies Virus gB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型、傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒[1]。豬是偽狂犬病的自然宿主，對其危害大。可致妊娠母豬流產，產死胎及胎兒干尸化。對初生仔豬則引起神經癥狀，出現運動失調，麻痹，衰竭死亡，病死率 100%。成年豬多呈隱性感染，但可引起呼吸道癥狀[2]。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源，病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的帶毒豬可持續排毒一年。
本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測偽狂犬病毒，對偽狂犬病毒引起的疾病及其并發癥的診斷及療效評估有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對偽狂犬病毒gB基因高度保守區基因序列設計特異性引物和熒光探針[3]。在反應體系中含偽狂犬病毒gB基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放 熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性、定量分析。
【試劑組成】
名 稱 規 格
核酸提取液 1.5mL×2 管
酶液 50μL×1 管
PRV-gB 反應液 1.0mL×1 管
PRV-gB 陽性質控品 50μL ×1 管
陰性質控品 250μL ×1 管
注：
1）丌同批號試劑丌能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數丌超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺的豬，取腦、淋巴結、脾臟、肺臟等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5mL。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但丌能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從 3 個丌同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取
0. 5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提取；血液取血清 100μL 提取。
1.2DNA 提取
1)對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000
rpm 離心 5min，取上清液轉移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；
2)DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產的 DNA 提取試劑盒
（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣本總數每滿 7 份，則多配制 1 頭份 PCR 反應液)，單個測試反應液體系配制如下表：
試劑 PRV-gB 反應液 酶液
用量（樣本數為 N） 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3.
加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、
stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴增曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，丏出現明顯曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果如果同樣出現 Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。
6.質控標準
陰性對照：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性對照：擴增曲線有明顯指數生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
Ø樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
Ø樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
Ø陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
Ø病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
Ø丌同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
Ø試劑運輸，保存丌當或試劑配制丌準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測丌準確的結果；
【注意事項】
Ø所有操作嚴格按照說明書進行；
Ø試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
Ø反應液應避光保存；
Ø反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
Ø使用一次性吸頭、一次性手套和各區與用工作服；
Ø樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
Ø實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
Ø試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]婁高明，杜偉賢．偽狂犬病流行概況及豬場防制策略[Ｊ]．中國動物檢疫，1999， 16（5）：43－45.
[2]殷震，劉景華．動物病毒學[Ｍ]．北京：科學出版社，1997.
[3]朱淑芬,朱瑞良,喬彩霞.檢測偽狂犬病毒ｇＢ基因熒光定量ＰＣＲ方法的建立[J].中國獸醫學報，2012，32（10）:1413-1417.
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