熒光定量PCR使用說明
【試劑盒簡(jiǎn)介】
豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)豬血清和組織中的PRV，適用于PRV的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【原理】
提取DNA作為模板，在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。
【試劑盒組份】
| 1. 裂解液 | 8mL | 8. 陽(yáng)性對(duì)照 | |
| 2. 蛋白酶K | 110μL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個(gè) |
| 3. 抽提液 | 8mL | 10. PCR 反應(yīng)液A | 180μL |
| 4. 異丙醇 | 7mL | 11. PCR 反應(yīng)液B | 50μL |
| 5. 洗滌液 | 12mL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
| 6. 無(wú)菌水 | 500μL | 13. 染色液 | |
| 7. 陰性對(duì)照 | 300μL | | 10μL |
注：塑料袋內(nèi)試劑（陽(yáng)性對(duì)照、蛋白酶K、PCR反應(yīng)液A和B）-20 ℃凍存，其他室溫保存。
| M1檢測(cè)試劑盒（酶免） |
| 三聚氰胺檢測(cè)試劑盒（酶免） |
| 磺胺二甲基嘧啶檢測(cè)試劑盒（酶免） |
| 孔雀石綠定量檢測(cè)試劑盒（酶免） |
金霉素定量檢測(cè)試劑盒（酶免）
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【熒光定量PCR操作方法】
一、病毒DNA的提取
1.取出已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動(dòng)，不要吸到上層保護(hù)液)，用力顛倒10次混勻，12,000rpm離心10min。
2.取500µL上清置于滅菌離心管中，加入500µL異丙醇，混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管，室溫融化，13,000rpm離心15min。
3.棄上清，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液，輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
4.用30µL無(wú)菌水溶解沉淀，作為模板備用。
二、樣品制備
1樣品采集：病死或撲殺的豬，取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結(jié)等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2樣品處理：
2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無(wú)塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
2.2全血樣品的處理：待血凝后取血清放于離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
2.3陽(yáng)性對(duì)照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
2.4陰性對(duì)照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
三、PCR
1.反應(yīng)體系：分別取16µLPCR反應(yīng)液A(用前混勻)、2µLPCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板DNA，混勻。
2.反應(yīng)程序：在PCR儀上運(yùn)行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
四、電泳
1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無(wú)帶出現(xiàn)(引物帶除外)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為豬偽狂犬病毒陽(yáng)性，否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
【豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒注意事項(xiàng)】
1.本試劑盒有效期為6個(gè)月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存，使用時(shí)拿到室溫下，使用后立即放回。
