ELISA是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，可以用于檢測血液、尿液、唾液、霉菌、病毒、細菌等生物樣品中的蛋白質(zhì)、抗體、肽等生物分子。
ELISA全名是酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)的縮寫，是一種利用酶標記化的抗體或反體與待檢測物(抗原或抗體)結(jié)合，從而間接或直接檢測目標分子的技術(shù)，屬于免疫學(xué)中的非放射性標記方法之一。
ELISA實驗代測步驟：
一般分為六個步驟：涂覆微孔板、酶標記化的抗體反應(yīng)、樣品添加、次級抗體結(jié)合、添加底物、測量光密度。
1.涂覆微孔板
將捕獲抗體、配體或抗原涂覆在微孔板上，使之附著在微孔板的底部或壁上，固定在樣品檢測位置或加標準的位置。同時，涂覆后還需要加入一些特殊蛋白或物質(zhì)，例如牛血清白蛋白(BSA)等，將微孔板的其他部分進行屏蔽，以防止非特異性結(jié)合。
2.酶標記化的抗體反應(yīng)
將酶標記化的初級抗體與樣品或標準物質(zhì)反應(yīng)，待時間到達絕大部分初級抗體與待檢測物或標準物質(zhì)特異性結(jié)合時，將液不沖洗干凈。
3.樣品添加
將待檢樣品加入涂覆好初級抗體的微孔板中，讓待檢樣品以及標準物質(zhì)特異性結(jié)合到微孔板上涂覆好的初級抗體中。該過程也需要將板子洗液清洗干凈。
4.次級抗體結(jié)合
將酶標記化的次級抗體加入孔內(nèi)，經(jīng)過適當?shù)姆磻?yīng)時間，使之與待測樣中的物質(zhì)結(jié)合。該步驟結(jié)束后，需要將板子進行洗滌，以消除非特異性結(jié)合。
5.添加底物
將含有酶基團的底物加入微孔板中，例如TMB、ABTS等底物，如果樣品物質(zhì)合適，底物在酶催化下會產(chǎn)生顯色反應(yīng)。直觀表示是微孔板中某些孔的液體呈現(xiàn)橘黃色，根據(jù)底物種類的不同，孔底深度和底物的反應(yīng)時間也會有所不同。
6.測量光密度
在吸光度計或ELISA檢測儀器上對微孔板進行讀數(shù)，根據(jù)微孔板中總體積、底物的反應(yīng)時間和吸收量來計算樣品中待檢測物質(zhì)的濃度。通常，結(jié)果是一個數(shù)字，可以根據(jù)該數(shù)字來評估待檢測物質(zhì)的存在程度或含量。
實驗注意事項：
1.微孔板的處理
微孔板是ELISA實驗中的重要物品，拆開之前必須放在干凈的環(huán)境中進行消毒，盡量避免接觸銳器或其他銳利物品，使用完后及時封閉保存，避免受到污染。
2.操作流程的嚴謹性
實驗需要嚴格的操作流程和重復(fù)性，每個流程必須按照操作規(guī)程進行，且操作者必須熟練掌握操作技巧和注意事項，避免因操作不當引起實驗的誤差。
3.化學(xué)品的正確使用
實驗中需要使用各種化學(xué)試劑，包括酶標記的抗體、底物、緩沖液、洗滌液等，每個化學(xué)品都有其特殊的儲存、使用和處理方法，必須按照說明書的要求進行正確使用，避免發(fā)生安全事故或影響實驗結(jié)果。
4.數(shù)據(jù)的分析
ELISA測量數(shù)據(jù)的分析非常重要，必須進行合理的分析和解釋，避免由于數(shù)據(jù)誤差或結(jié)果解釋不當而導(dǎo)致實驗結(jié)論的錯誤。
