熒光定量PCR是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測DNA或RNA樣本中的特定序列。這種技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。
一、原理
這是一種以熒光信號為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)，它是利用熒光染料標(biāo)記的靶分子在PCR反應(yīng)過程中的特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)DNA分子定量分析的一種方法。
熒光定量PCR分為兩種方法：染料法和探針法。是一種結(jié)合雙鏈DNA的染料，它在PCR反應(yīng)過程中結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物中，產(chǎn)生特異性熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)的熒光定量。探針法是利用特殊的探針標(biāo)記目標(biāo)序列，這種探針在熒光棒上加有熒光基團(tuán)，只有在PCR反應(yīng)的溫度高于探針的脫離溫度時(shí)，才能與目標(biāo)序列特異性雜交并釋放熒光信號，其子類包括TaqMan探針、分子信標(biāo)探針和通量探針等。
二、技術(shù)方法
1.樣本的制備
需要進(jìn)行精細(xì)樣品制備，樣品制備方式與檢測目的密切相關(guān)。例如，如果是檢測基因的表達(dá)水平，需要提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，如果要檢測特定DNA序列，可以用PCR擴(kuò)增獲取擴(kuò)增產(chǎn)物，并進(jìn)行目標(biāo)序列的純化或酶切等操作。
2.PCR反應(yīng)體系的制備
PCR反應(yīng)體系的制備需要注意靈敏度和特異性，并且需要進(jìn)行良好的優(yōu)化。體系包括模板、引物、酶和緩沖液等。引物是qPCR的關(guān)鍵部分，它必須能夠牢固地結(jié)合到樣品DNA上，擴(kuò)增出特定的擴(kuò)增產(chǎn)物。緩沖液用于維持PCR反應(yīng)體系的pH和離子強(qiáng)度，酶則是擴(kuò)增產(chǎn)物的生成催化劑。
3.PCR反應(yīng)過程
PCR反應(yīng)過程分為三個(gè)階段：變性、退火和延伸。擴(kuò)增參數(shù)如溫度和時(shí)間等會(huì)影響PCR效率和特異性，溫度和時(shí)間要根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化。
4.數(shù)據(jù)分析和結(jié)果的解釋
結(jié)果需要通過熒光曲線得到，并在以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)的測量下，通過一系列的基因表達(dá)分析軟件進(jìn)行分析。
三、技術(shù)應(yīng)用
1.基因表達(dá)分析
可以用于基因表達(dá)與調(diào)控研究，利用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)或不同處理?xiàng)l件下目標(biāo)基因的表達(dá)量的定量測量，進(jìn)而探究基因的功能和調(diào)控機(jī)理，以及生物發(fā)育、疾病診斷等領(lǐng)域中的應(yīng)用。
2.微生物檢測
可以在不需要生長或培養(yǎng)微生物的情況下，通過在其核酸序列上進(jìn)行PCR反應(yīng)和熒光定量來檢測微生物的存在和含量。這種方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更快、更靈敏和更準(zhǔn)確。
3.進(jìn)化研究
可以用于研究特定DNA序列的變異和多態(tài)性，并確定DNA序列的起源和進(jìn)化方向。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)進(jìn)化、物種鑒定和親緣關(guān)系等領(lǐng)域中。
4.腫瘤診斷
可以用于診斷某些腫瘤的存在和發(fā)展。比如可以在患者血液、組織和體液等樣品中檢測癌細(xì)胞的DNA或RNA，在早期檢測和治療方面有重要的臨床價(jià)值。
四、注意事項(xiàng)
1.PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化
PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化對于結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性十分重要。需要根據(jù)反應(yīng)目的和所需的特定樣品的特征對PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。
2.選擇合適的引物和熒光探針
引物的設(shè)計(jì)應(yīng)該充分考慮基因序列的一些特異性區(qū)域，特別是SNP和Indel的分布，避免出現(xiàn)位點(diǎn)失配。而熒光探針的類型應(yīng)該根據(jù)技術(shù)的目的和反應(yīng)特點(diǎn)進(jìn)行選擇。
3.樣品的制備和保存
樣品制備和保存的方式應(yīng)該依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩āＬ貏e要注意的是，樣品在制備和保存過程中避免受到污染和退化。
4.充分掌握數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀的技巧和方法
結(jié)果不能僅僅從熒光曲線和計(jì)數(shù)得到，還需要進(jìn)行基因表達(dá)、SNP分析和組織分析等一系列的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。需要充分掌握數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)技巧。
總之，qPCR技術(shù)已成為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中DNA、RNA檢測和定量的主要手段之一，更加便捷、靈敏、準(zhǔn)確。但仍需注意技術(shù)細(xì)節(jié)和數(shù)據(jù)分析，避免出現(xiàn)誤差和失誤。隨著該技術(shù)不斷的完善和應(yīng)用，相信它將更加發(fā)揮其重要性。
